我們可能都有過這樣的經(jīng)歷：

辛苦呵護的細胞，怎么也不愿意貼壁；

貼壁了又很容易成塊或者成團掉下來；

原本貼壁的細胞，復蘇后細胞不貼壁了；

........

遇到這樣的問題你都如何解決？

這次我們就來聊聊

什么是貼壁細胞？

貼壁細胞原理？

細胞貼壁和什么有關？

為啥你的細胞不愿貼壁呢？

如何促進細胞貼壁？
 

根據(jù)細胞特性分類

1、 懸浮細胞（Suspension Cell）

細胞生長不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長，如淋巴細胞。

2、 貼壁細胞（Adherent Cell）

在動物細胞培養(yǎng)過程中，必須有可以貼附的支持物表面，依靠自身分泌或培養(yǎng)基中的粘附因子才能在該表面生長增殖的細胞。當細胞在該表面生長后，一般形成兩種形態(tài)，即成纖維樣細胞或上皮樣細胞。

▲ 細胞形態(tài)

3、 兼性貼壁細胞

有些細胞并不嚴格地依賴支持物，它們既可以貼附于支持物表面生長，但在一定條件下，也可在培養(yǎng)基中呈懸浮狀態(tài)生長。

貼壁細胞分為：上皮細胞型，成纖維細胞型，游走細胞型和多型細胞型，在顯微鏡下觀察時，貼壁細胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不規(guī)則的三角形或扇形或其他形態(tài)，而且晃動培養(yǎng)液時，細胞不動。常見的貼壁細胞有成纖維細胞、骨骼組織（骨及軟骨）、心肌與平滑肌、肝、肺、腎、乳腺皮膚、神經(jīng)膠質細胞、內分泌細胞、黑色素細胞以及各種腫瘤細胞等。

體外培養(yǎng)貼壁細胞特點

貼附并伸展，是多數(shù)體外培養(yǎng)細胞的基本生長特點。細胞貼壁的過程使形態(tài)發(fā)生很大變化，細胞形態(tài)改變是細胞內骨架（真核細胞中的蛋白纖維網(wǎng)架體系，由微管、微絲及中間纖維組成的體系）本身和細胞外基質共同作用的結果。培養(yǎng)細胞在未貼附于底物之前一般均似球體樣，當與底物貼附后，細胞將逐漸伸展而形成一定的形態(tài)，呈成纖維細胞樣或上皮細胞樣等。細胞附著于底物時并非一種需要能量的過程，一般認為與電荷有關。據(jù)資料記載，37℃時在2min內細胞之間即可形成鍵，該鍵可對0.01%胰蛋白酶起作用且僅發(fā)生于細胞間，細胞與底物之間則無；8min后才有穩(wěn)定的鍵形成。

貼壁細胞（除腫瘤細胞外）在體外培養(yǎng)條件下，完成貼壁后均為單層生長，原因是貼壁細胞有接觸性抑制的特點。一般認為接觸抑制是細胞間的一種識別作用，對于動物細胞的形態(tài)形成與穩(wěn)定具有重要性的作用。由于貼壁細胞的一面是緊貼在培養(yǎng)瓶上的，如果其上方存在細胞與其相粘附，那么下方的細胞很快就會缺乏營養(yǎng)---餓死。

接觸抑制：

1954年，由艾伯克龍比發(fā)現(xiàn)，一些細胞在生長過程中達到相互接觸時停止分裂現(xiàn)象，將其命名為接觸性抑制（Contact Inhibition），后來證實接觸性抑制普遍存在于貼壁細胞之間。

接觸抑制的原理：細胞膜上有糖類和蛋白質共同構成的糖蛋白，也叫做糖被，它在細胞上起識別作用，當細胞增殖到一定程度，挨在一起時，糖蛋白就會識別這種信號，并且使細胞停止繁殖。

▲ 單層生長

細胞為什么要貼壁

首先并不是所有的細胞在體外培養(yǎng)的情況下都會貼壁，但大部分來自實體組織器官的細胞都會貼壁。

密度大于培養(yǎng)基的細胞（絕大部分細胞）通過重力作用會沉降在底面上，這是種自然屬性，那么細胞要生存必定得改善這個環(huán)境，也是貼壁的主要原因-分泌細胞外基質和粘附因子（Extracellular matrix& Cell Adhesion Molecules，ECM&CAM），改善底面的結構，然后很自然就貼附在底面上了。

細胞粘附分子：

是眾多介導細胞間或細胞與細胞外間相互接觸和結合分子的統(tǒng)稱。

細胞外基質：

是由動物細胞合并分泌到胞外、分布在細胞表面或細胞之間的大分子。

二者大多數(shù)均為糖蛋白，因此具有較強的親水性——因此能不能貼壁不僅僅關乎細胞是否有這種能力，也與有無合適的底物（培養(yǎng)瓶）有關。

▲ 原理圖（圖源網(wǎng)絡）

密度小于水的細胞，如脂肪細胞，漂浮在液面上，所以不可能貼在底面上，但是如果將培養(yǎng)液加滿，那么細胞能夠與培養(yǎng)瓶上面的壁接觸同樣可以貼壁。因此可以說，細胞貼壁是適應環(huán)境的一種反應。

細胞貼壁原理及相關因素

大多數(shù)的哺乳動物細胞在體內和體外均附著于一定的底物而生長，在體外時這些底物可以是其他細胞、膠原、玻璃或塑料等。

貼壁的過程：細胞首先分泌細胞外基質，這種細胞外基質黏附在支持物的表面（培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿的底面）。然后，細胞通過其表面表達的黏附因子與這些細胞外基質結合。

▲ 貼壁過程

一些特殊的促細胞附著物質（如層粘連蛋白、纖維連接蛋白、Ⅲ型膠原、血清擴展因子等）可能參加細胞的貼附過程。這些促細胞附著因子均為蛋白質，存在于培養(yǎng)液尤其是血清中。在培養(yǎng)過程中，這些帶陽電荷的促貼附因子先吸附于底物上，懸浮的圓形細胞再與已吸附的有促貼附物質的底物附著，以后細胞將伸展成其原來的形態(tài)。所以細胞貼壁與否和細胞本身分泌細胞外基質的能力以及細胞本身表達的黏附分子的數(shù)量有關，也與培養(yǎng)皿壁的表面結構有關。

細胞不貼壁的一些原因

• 1. 胰酶消化時間把控不當：消化不夠細胞本身就是成團的；若胰酶處理太久，容易造成細胞膜蛋白損傷，使細胞貼壁不緊，顯微鏡下觀察立體感不強，嚴重的時候甚至會造成細胞死亡。

• 2. 缺少貼壁因子：血清中含有促貼壁因子，而無血清培養(yǎng)基工藝中由于缺少這種促貼壁因子，細胞的貼壁效果會下降很多。

• 3. 支原體或細菌的污染。

• 4. 培養(yǎng)液配制、儲存不當，如pH值過堿，Gln量太少等原因。

• 5. 復蘇的細胞本身狀態(tài)不好，已經(jīng)老化，失去貼附性。

• 6. 接種細胞數(shù)目太少，無法分泌足夠的細胞外基質。

• 7. 復蘇時處理速度太慢，復蘇過程不當。
   

如何促進細胞貼壁

• 1. 適度消化細胞：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901幾種癌細胞處理時間可適當放長，一般處理5-6min，C2C12、COS-7、NIH-3T3比較容易脫落，2min足矣，P19Cl6和293細胞貼壁不緊，可在PBS漂洗后，直接換新鮮培養(yǎng)基打散。

• 2. 用塑料瓶培養(yǎng)，如果是玻璃瓶,那么可以用鼠尾膠原包被一下培養(yǎng)瓶，或者用鹽酸對培養(yǎng)瓶進行蝕刻，或者涂Laminin/fibronectin/collagen/BSA，也可以幫助細胞貼附新的培養(yǎng)瓶，細胞不易貼壁，建議加多聚賴氨酸處理。

• 3. 正確配制消化液或培養(yǎng)液。

• 4. 使用合適的細胞外基質或貼壁試劑。

• 5. 復蘇新的細胞，第1周用20%血清幫助細胞復原。

• 6. 傳代接種一定要鋪的均勻，避免細胞抱團生長。

• 7. 細胞傳代24小時之內，不要晃動，以免影響貼壁。

• 8. 體內上皮細胞生長在膠原構成的基膜上，因此培養(yǎng)在有膠原的底物上有利于生長。人或小鼠表皮細胞培養(yǎng)，可以用γ射線照射后的3T3細胞為飼養(yǎng)層，另外降低pH、Ca²⁺含量和溫度，均有利于上皮細胞生長。

  　　Countess3細胞計數(shù)儀雖然是一款高效的細胞計數(shù)工具，但它本身并不直接涉及細胞貼壁的問題。

  　　細胞不貼壁是在細胞培養(yǎng)過程中常見的問題，可能會影響到實驗結果的準確性和細胞的正常生長。

  　　以下是關于細胞不貼壁的一些原因及可能的解決方案：

  　　細胞不貼壁的原因：

  　　培養(yǎng)基條件不適：

  　　pH值不適當：理想的細胞生長pH范圍通常在7.2到7.4之間。過高或過低的pH值都可能影響細胞貼壁。

  　　營養(yǎng)不足：培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分不足或比例不適當，可能導致細胞無法正常貼壁生長。

  　　氧氣或二氧化碳濃度不適：特別是在CO2孵化器中，不恰當?shù)腃O2濃度會影響培養(yǎng)基的pH值，從而影響細胞貼壁。

  　　細胞本身的問題：

  　　細胞狀態(tài)不佳：如在傳代過程中受損或凍存復蘇過程中受到影響的細胞，可能活力下降，導致無法正常貼壁。

  　　細胞類型特性：有些細胞類型(如懸浮細胞系)自然不易貼壁，需要特殊的培養(yǎng)條件或添加特定的附著因子。

  　　培養(yǎng)容器問題：

  　　容器表面處理不當：細胞可能需要經(jīng)過特殊處理的表面才能有效貼壁，如膠原蛋白或纖維連接蛋白涂層。

  　　容器污染：微生物污染或化學污染也可能影響細胞的貼壁。

  　　操作技術：

  　　播種密度不當：播種密度太低或太高都可能影響細胞的貼壁和生長。

  　　操作過程中的機械損傷：過度的吸吐或劇烈的震蕩可能會損傷細胞，導致其無法貼壁。

  　　解決方案：

  　　調整培養(yǎng)基條件：確保pH值、營養(yǎng)成分和氣體濃度處于適宜范圍。

  　　優(yōu)化細胞狀態(tài)：選擇健康、活力好的細胞進行培養(yǎng)，避免使用受損或狀態(tài)不佳的細胞。

  　　選擇合適的培養(yǎng)容器：根據(jù)細胞類型選擇合適的培養(yǎng)容器，并確保其表面處理適合細胞貼壁。

  　　提高操作技術水平：避免在細胞操作過程中造成不必要的機械損傷，合理控制播種密度。

  　　引入附著因子：對于不易貼壁的細胞類型，可以嘗試添加特定的附著因子來促進細胞貼壁。

  　　使用懸浮培養(yǎng)方法：對于某些自然不易貼壁的細胞類型，可以考慮使用懸浮培養(yǎng)的方法進行培養(yǎng)。

  　　解決細胞不貼壁的問題需要從多個方面綜合考慮，包括培養(yǎng)基條件、細胞狀態(tài)、培養(yǎng)容器和操作技術等。通過優(yōu)化這些條件和技術，可以有效地促進細胞的貼壁和生長。